Детская Стоматология

Будущее: Стволовые клетки и попытки регенерации пульпы

Jacques E. Nor, Carolina Cucco

  2912

Введение

Длительная и полная регенерация пульпы в зубах с глубоким кариесом или при обширной травме остается серьезной клинической задачей. В зубах с несформированной верхушкой при обнажении тканей пульпы обычно показан метод частичной или полной пульпотомии для сохранения функциональности пульпы, что позволит корням деформироваться.

В случаях, когда травма привела к гибели пульпы и вызвала задержку развития корня, может быть нарушено соотношение коронки и корня, у корня будут очень тонкие стенки и открытая верхушка. В таких случаях требуется восстановление функционального дентинно-пульпарного комплекса, который создает возможность для завершения развития корней и утолщения дентинных стенок корня. Этот результат может быть достигнут с помощью внедрения апикальных стволовых клеток в корневой канал и/или при трансплантации стволовых клеток, используя подход, основанный на тканевой инженерии.

Консервативные методы лечения пульпы использовались в течение многих лет в попытке сохранить жизнеспособность пульпы при травме. С открытием функции стволовых клеток в тканях пульпы зуба, поиск биологических подходов, использующих эти клетки для регенерации пульпы вырос в геометрической прогрессии. Хорошо известно, что пульпа зуба уязвима перед повреждениями, такими как кариес, инфекции и травмы. В то время как современные подходы к лечению этих состояний ориентированы прежде всего на сохранение нарушенной структуры зуба, будущие подходы имеют в качестве конечной цели полную регенерацию тканей зуба (то есть, дентина и пульпы), даже в случаях некроза пульпы у молодых зубов. Эти концепции регенеративных эндодонтических процедур направлены на повышение прочности зуба и поддержание (или восстановление) жизнеспособности пульпы с акцентом на регенерацию тканей и жизнеспособность зуба.

С выделением постнатальных стволовых клеток из различных источников в ротовой полости и разработкой биосовместимых материалов для доставки клеток и фактора роста, возможности для альтернативных методов лечения, основанных на клеточной биологии становятся все более реальными. Междисциплинарные подходы необходимы, чтобы перейти от замены к регенерации, при участии врачей, а также клеточных биологов и материаловедов. В этой главе мы сначала рассмотрим основные принципы развития зубов, которые могут быть применены для создания сигнальных систем для тканевой инженерии. Для регенерации отдельных структур зуба обсуждается классическая тканевая триада, то есть стволовые клетки, каркасные материалы и морфогенетические факторы. Представлены новые предложения тканевой инженерии, направленные на регенерацию дентинно-пульпарного комплекса.

При прогнозировании будущих направлений мы кратко обсудили ключевые компоненты необходимые для разработки эффективных стратегий тканевой инженерии пульпы зуба, которые позволят нам применить новейшие регенеративные стратегии в клинической практике в ближайшем будущем.

Лечение пульпы молочных и несформированных постоянных зубов

В последние годы в эндодонтии уделяется все большее внимание консервативным методам лечения заболеваний пульпы. В рамках складывающейся парадигмы восстановительной эндодонтии, стволовые клетки и технологии тканевой инженерии предлагают возможность для восстановления и регенерации тканей дентина и пульпы при лечении зубов с некротической пульпой. 10 лет назад было сделано заявление, что пульпа зуба — это доступная ткань, из которой можно выделить постнатальные мезенхимальные стволовые клетки, особенно из молочных премоляров и постоянных моляров, удаленных по ортодонтическим показаниям. Зубы представляют собой превосходный источник стволовых клеток для регенерации тканей, из-за их высокой доступности, пролиферативной способности и мультипотентности.

В процессе разработки идет развитие одонтогенеза за счет молекулярного перекреста и взаимного взаимодействия между двумя морфологически различными тканями, эктодермы и подлежащей мезенхимы. Эта модель была признана ключевым механизмом организации морфогенеза других систем, включая волосы и железы. Понимание основных молекулярных механизмов формирования зуба является ключевым фактором для воссоздания этих процессов для тканевой инженерии зубов. Уникальный набор сигнальных молекул, в том числе sonic hedgehog и костные морфогенетические белки, играют важную роль в контроле формирования зубов. Непостоянные взаимодействия между эпителием и мезенхимой зависит от стадии развития (см. Главу 2). Понимание временной и пространственные структуры этих взаимодействий может быть ключевым фактором профиля развития и формирования зубов для тканевой инженерии в будущем.

«Сверхзвуковой ёжик» (sonic hedgehog). SHH, sonic hedgehog, — это ген, кодирующий один из трёх белков семейства hedgehog («ёжиков»), названный так в честь героя популярной видеоигры Sonic the Hedgehog, вышедшей в 1990-е годы. (Строго говоря, sonic hedgehog — это «ёжик со скоростью звука», но в переводе отечественных геймеров он стал сверхзвуковым). Ген sonic hedgehog, играющий ключевую роль в органогенезе млекопитающих, впервые найден всё у той же дрозофилы. Продукт гена в числе прочего влияет на то, как будет сегментировано тело плодовой мушки. У эмбрионов дрозофил, у которых этот ген выключен, по всему телу формируются маленькие шипики. Подробнее см.: https://www.nkj.ru/archive/articles/24070/ (Наука и жизнь, Генетики тоже шутят)

Прим. переводчика

Восстановление пульпы зуба

Регенерации отдельных структур зуба является более реалистичной перспективой на ближайшее будущее чем регенерация целого зуба. Первые культуры стволовых клеток, полученные из зрелых тканей пульпы зуба, были названы стволовыми клетками пульпы зуба (СКПЗ — DPSCs). Вскоре после этого, удаленные молочные зубы были признаны важным источником постнатальных стволовых клеток (стволовые клетки из удаленных молочных зубов человека — СКМЗ — SHED). И СКПЗ, и СКМЗ являются клоногенными, формирующими адгезивными клеточными кластерами и способны к мультипотентной дифференцировке. По сравнению со стромальными стволовыми клетками костного мозга, они проявляют более высокую скорость распространения и удвоения популяции на 30–50%. Анализ микромассивов выявил отличительный ген экспрессии паттерна СКПЗ по сравнению со стромальными стволовыми клетками костного мозга. Экспрессия маркеров минерализации и формирования очагов минерализации наблюдается, когда эти клетки культивируются в присутствии индукторов, содержащих аскорбиновую кислоту, дексаметазон, и неорганический фосфат. После трансплантация n vivo, как СКПЗ, так и СКМЗ способны к восстановлению дентинно-пульпарного комплекса как показано на Рис. 9.1. Во всем мире становятся широко доступны услуги по консервированию и хранению клеток выпавших молочных зубов или удаленных постоянных зубов.

Стволовые клетки пульпы также могут быть получены из зубного сосочка, органа, из которого образуется пульпа зуба. Стволовые клетки апикальных сосочков, которые дают начало одонтобластам, отвечающим за формирование дентина корня, могут быть получены из формирующихся зубов мудрости, они проявляют высокую способность к регенерации дентина, так как они, вероятно, менее дифференцированы по сравнению с СКПЗ.

Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из тканей зуба экспрессируют STRO-I, это предполагаемый маркер мезенхимальных стволовых клеток; была продемонстрирована их возможность дифференцироваться в одонтобласты, остеобласты, адипоциты и нервные клетки. СКПЗ также показали положительный результат в отношении альфа-актина гладких мышц, CD146 и перицит ассоциированного антигена (3G5). Недавно было доказано, что стволовые клетки пульпы зуба находятся в периваскулярных нишах.

Безымянный.jpgРис. 9.1 Клетки пульпы, образованные за счет стволовых клеток пульпы зуба человека (СКПЗ). Постнатальные стволовые клетки были высеяны на срезы зуба/ каркасы и трансплантированы в организм мышей с иммунодефицитом. Микрофотографии образованной ткани пульпы спустя 2 и 3 недели после трансплантации. Для идентификации СКПЗ мы трансдуцировали их при помощи lacZ гена, которые окрашивает эти клетки синим в ответ на воздействие β-галактозидазы.

Факторы роста и дифференцировки

Углубленное понимание биологических процессов, происходящих во время развития и восстановления зуба, создает предпосылки для усиления репаративного ответа и регенерации тканей. Матрица дентина содержит огромное число белков и факторов роста, способных стимулировать восстановление тканей. Эти факторы роста секретируются клетками пульпы и осаждаются в матрице дентина во время минерализации, где они остаются защищенными в активной форме. Деминерализация дентина после применения протравливающего агента, препарата для покрытия пульпы, или даже во время препарирования полости, высвобождает эти факторы роста и делает их доступными для окружающих клеток. Вероятно, они играют ключевую роль в регулировании формирования репаративного дентина. Факторы роста, особенно трансформирующий ростовой фактор бета (TGF-beta), являются важными участниками клеточного сигнала; они стимулируют дифференцировку одонтобластов и секрецию матриксного дентина, что приводит к увеличению формированию репаративного дентина.

Другим важным семейством факторов роста в развитии и регенерации зубов являются костные морфогенетические белки (BMP). Рекомбинантный человеческий BMP-2 стимулирует дифференцировку взрослых стволовых клеток пульпы в одонтобласто- подобный тип клеток в культуре. Подобные индуктивные эффекты TGF-бета 1–3 и BMP-7 были продемонстрированы в культивируемых срезах зубов. Рекомбинантные BMP-2, BMP-4, и ВМР-7 индуцируют образование репаративного дентина n vivo. Было обнаружено, что применение инсулиноподобного фактора роста (IGF)-1 стимулирует образование дентинных мостиков, что сравнимо с воздействием гидроксида кальция (в качестве препарата для покрытия пульпы).

В дополнение к факторам роста, было открыты другие вещества для стимуляции дифференцировки клеток пульпы. Матриксный белок дентина-1 (DMP) -I, это не коллагеновый белок, участвующий в процессах минерализации, индуцирует клеточную дифференцировку, синтез коллагена и кальцинированных отложений после прямого покрытия пульпы в опытах на животных. Дексаметазон это синтетический глюкокортикоид, снижающий клеточную пролиферацию и индуцирующий экспрессию щелочной фосфатазы и дентинного сиалофосфопротеина в клетках пульпы молочных зубов человека. Добавление бета-глицерофосфата к культуральной среде клеток, эксплантированных из зубов человека, индуцирует изменение клеточной морфологии, синтез коллагена и минералообразование. В нескольких исследованиях были использованы комбинации дексаметазона с неорганическим фосфатом для дифференцировки стволовых клеток и индукции минерализации. Ключевым моментом является то, что известны биологические регуляторы клеток пульпы, которые рассматривались в качестве потенциально возможных терапевтических методик в регенеративной эндодонтии.

Каркас для стволовых клеток

Каркас являются поддерживающим приспособлением для клеток, обеспечивающим трехмерную структуру для клеточной адгезии, миграции и дифференцировки. В идеале, он должен биодеградировать с такой же скоростью, с какой образуются новые ткани. Каркасные материалы должны быть биологически совместимыми и нетоксичными. Для инженерии тканей пульпы предпочтительнее инъекционные методики. Природные полимеры, такие как коллаген, эластин, гликозаминогликаны, фибрин, альгинат, шелк и хитозан, уже давно используются в качестве поддерживающих структур. Несмотря на то что эти материалы обеспечивают структурную прочность и являются биологически совместимыми и биодеградируемыми, у них мало возможностей для управления структурой или создания композиционных изменений, для улучшения производительности. Синтетические полимеры обеспечивают высокую степень контроля механических и химических свойств. Полимолочная кислота (ПМК), полигликолевая кислота (ПГК) и их сополимер поли-лакто-ко-гликолевая кислота (PLGA) широко используются для инженерии тканей, включая регенеративную стоматологию. Гидрогель особенно интересен тем, что за счет своих тканеподобных вязкоупругих свойств, возможна эффективная транспортировка питательных веществ и продуктов обмена, равномерная инкапсуляция клеток, и возможность инъекции и гелеобразования in situ. Гели состоят из полиэтиленгликоль-фибрина, гликозаминогликанов, или основаны на строительных блоках пептидов. На основе их химических свойств, они могут быть химически или физически сшиты, и возможны модификации, такие как включение биофункциональных молекул и факторов роста и дифференцировки.

Тканевая инженерия в эндодонтии

Концепция тканевой инженерии была задумана Lunger and Vacanti в начале 1990-х годов, для описания методики регенерации биологических тканей. Тканевая инженерия относится к науке о создании новых живых тканей для замены, восстановления или увеличения патологически измененных/поврежденных тканей и возобновления функций ткани/органа.

Цель тканевой инженерии в эндодонтии — восстановление пульпо-подобных тканей, а в идеале восстановление пульпо-дентинного комплекса. Несформированные зубы с некротической пульпой не имеют остаточных предшественников клеток пульпы для продолжения развития корней.

Основные цели традиционной терапии корневых каналов — полная очистка, формирование и тщательная обтурация — не могут быть проведены в несформированных корнях. Кроме того, короткие, слабые, и склонные к перелому корни несформированного зуба становится еще слабее после механической обработки. Апексификация с использованием Са(ОН)2 или апикальной пробки может решить многие проблемы, связанные с традиционной терапией корневых каналов; тем не менее, все еще существует риск горизонтального перелома корня особенно в пришеечной области и подвижности зубов вследствие нарушения соотношения коронки и корня (Гл. 8).

Апексификация с использованием Ca(OH)2, была предложена Frank (1966), Са(ОН)2 используется в нескольких посещений в течение длительного периода для стимуляции развития апикального барьера. Помимо длительного периода лечения, продолжительный контакт Са(ОН)2 с дентином уменьшает механическую прочность дентина, что делает зуб восприимчивым к переломам. Cvek (1992) сообщил о более высокой частоте цервикального перелома корня из-за травмы в запломбированных корневых каналах несформированных зубов по сравнению со сформированными зубами. Поэтому сохранение (или восстановление) витальности пульпы несформированных зубов с глубоким кариесом или травмой имеет большое значение.

Несколько исследовательских групп, изучающих тканевую инженерию пульпы, предложили сохранять зуб витальным, первоначально эта идея была предложена группой David Mooneys в университете Мичигана в девяностых годах. Фибробласты пульпы культивировались на PGA каркасе 60 дней, клетки делились и образовывали ткань, схожую с тканями пульпы. Bohl и др. проверили влияние различных каркасных материалов на пролиферацию и синтез коллагена фибробластами пульпы 2 года спустя и выявили, что PGA наиболее благоприятный каркас, по сравнению с альгинатом и гидрогелем коллагена I типа. Пульпо-подобные ткани были получены с использованием СКПЗ в комбинации с коллагеновым каркасом и DMP-I в качестве морфогенетического фактора на дентинных срезах после трансплантации in vivo. Наша группа использовала СКМЗ клетки, высеиваемые на полимерные каркасы внутри срезов зуба и пересаженные в организм мышей с иммунодефицитом. Пульпо-подобная ткань формировалась в срезах зуба через 2–4 недели, клетки, выстилающие дентин, показали экспрессию одонтобласт/остеобласт маркеров и образование микрососудов. Следует отметить, что СКМЗ дифференцировались в одонтобласты, которые синтезировали новые тубулярный дентин, подтверждая их дифференцировку в полностью функциональные клетки.

Группа ученых во главе с Galler продемонстрировала рост и дифференцировку стволовых клеток, полученных из различных тканей зуба в пегилированном гидрогеле фибрина. Клетки разрушали фибрин, заменяли его в коллагеновой матрице, а также осаждали минералы после остеогенной индукции. Кроме того, СКМЗ и СКПЗ были протестированы на совместимость с самоорганизующимся пептидным гидрогелем, в котором возможны несколько модификаций матрицы. Оптимизация пептидной последовательности путем включения адгезионной клетки в основную последовательность RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота) и матриксных металлопротеиназ (MMP)-2 — специфического фермента расщепления, привела к увеличению скорости пролиферации и усилению миграции СКМЗ и СКПЗ в эти матрицы. Более того, исследования с пептидами на основе гидрогелей, показало, что дифференцировка стволовых клеток пульпы зуба может быть стимулирована в этом типе матрицы.

Дальнейшие шаги в направлении индивидуальной системы включают в себя включение и медленное высвобождение факторов роста и дифференцировки, таких как трансформирующий фактор роста β1 (TGF-β1), фактор роста фибробластов 2 (FGF-2), и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).

Подходы к регенеративной эндодонтии

Ниже приведены возможные изученные подходы (рис. 9.2) для регенерации тканей пульпы: (A) Реваскуляризация корневого канала за счет свертываемости крови, (B) Постнатальная трансплантация стволовых клеток с использованием инъекционных каркасов, и © трансплантация пульпы с использованием стволовых клеток, выращенных в культуре. Эти методы основаны на принципах базовой тканевой инженерии и включают в себя аспекты стволовых клеток, факторов роста и каркасов. Из этих подходов, единственный, который в настоящее время утвержден для общего клинического применения в США и в ряде других стран, является «реваскуляризации корневого канала за счет свертывания крови» процедуры, которая называется просто «реваскуляризация» (см. главу 8). Тем не менее, подходы, использующие трансплантацию стволовых клеток это области фундаментального и трансляционного исследования, которое должно привести к клинической трансплантации в не столь отдаленном будущем.

Безымянный.jpgРис. 9.2 Стратегия инженерии тканей пульпы. Схема, изображающая три варианта тканевой инженерии пульпы зуба.

Реваскуляризация корневого канала за счет свертываемости крови

Nygaard Otsby (1961) впервые описал концепцию реваскуляризации, указывая устойчивое развития корня после индукции с помощью сгустка крови в корневом канале несформированного зуба с некротизированной пульпой. Соответственно, идеальным результатом для зубов с несформированным корнем и некротизированной пульпой будет формирование васкуляризированной ткани в пространстве корневого канала, способного индуцировать развитие нормального корня.

Процесс регенерации зависит от наличия остеобластов и одонтобластов стволовых клеток-предшественников в апикальном зубном сосочке, который может быть устойчивым к инфекциям и некрозу в канале из-за близ расположенных пародонтальных кровеносных сосудов. Цель заключается в том, чтобы создать подходящую среду для пролиферации периапикальных стволовых клеток в пространстве корневого канала, что способствует регенерации тканей пульпы и развитию корня.

Этот метод включает обработку корневого канала за пределами верхушки с целью формирования тромба. Она включает в себя использование внутриканальных ирригантов (например, разбавленный гипохлорит натрия, хлоргексидин) с внесением антибиотиков (смесь ципрофлоксацина, метронидазола и пасты миноциклина) на несколько недель. Это особое сочетание антибиотиков эффективно дезинфицирует систему корневого канала и увеличивает реваскуляризацию некротизированного зуба. Этот способ используется часто как относительно простой метод, он может быть выполнен с использованием стандартных инструментов и лекарственных средств. Следует отметить, что восстановление тканей в системе корневого канала происходит с помощью собственных клеток крови пациента, чтобы помогает избежать иммунного отторжения или передачи патогена при пересадке пульпы, сгенерированной при помощи тканевой инженерии.

Несмотря на простоту метода реваскуляризации, необходимо решить несколько проблем. Большая часть фактов в поддержку этого метода получена из тематических отчетов или исследований с небольшим числом случаев. Эта процедура, как правило, приводит к довольно непредсказуемым реакциям. Необходимы более точные исследования с более длительным периодом времени наблюдения, чтобы определить истинную вероятность успеха этой процедуры, а также показания для этого метода лечения. Тем не менее, это утвержденная клиническая процедура для регенеративной эндодонтии, что дает возможность лечения несформированных зубов с некротизированной пульпой биологическим методом.

Терапия постнатальными стволовыми клетками с использованием инъекционных методов

Возможным способом лечения несформированных некротизированных постоянных зубов с открытой верхушкой является трансплантация постнатальных стволовых клеток (например, СКМЗ, СКПЗ) в дезинфицированную систему корневого канала. Постнатальные стволовые клетки могут быть получены из нескольких тканей, в том числе кожи, слизистой оболочки щеки, жировой ткани, костей и пульпы зуба. Эти клетки должны быть пересажены в корневой канал с использованием каркасного материала.

Жесткий каркас обеспечивает превосходную поддержку клеток, костей и других участков тела, где сконструированные ткани должны обеспечить поддержку. Тем не менее, в системе корневых каналов, пульпа, созданная за счет тканевой инженерии, требуется не для того чтобы обеспечить структурную поддержку зуба. Это позволит тканям пульпы, созданным с помощью тканевой инженерии пульп, встроиться в мягкую 3D матрицу каркаса, такую как гидрогель. Гидрогель является инъекционным каркасом, который может быть внесен с помощью шприца. Гидрогель неинвазивный и легко вносится в систему корневых каналов. Он способствует регенерации пульпы, обеспечивая субстрат для пролиферации и дифференцировки клеток в организованной тканевой структуре. Чтобы сделать гидрогель более практичным, исследования сосредоточены на том, чтобы сделать его фотополимеризуемым, чтобы как только он имплантируется, формировались жесткие структуры. Работа лаборатории Galler ориентирована на развитие функциональных инъекционных каркасов, которые могут быть использованы для регенеративной эндодонтии. На самом деле, это очень захватывающая область исследования и существуют огромные возможности для сотрудничества между врачами, учеными, материаловедами и клеточными биологами.

Мы показали, что имплантация СКМЗ клеток в корни премоляров, трансплантированных подкожно мышам с иммунодефицитом, приводит к восстановлению пульпы зуба на всем протяжении корневого канала. Это особенно хорошо удается при использовании PuraMatrix, как инъекционного каркаса для доставки клеток. В отличие от этого, трансплантация СКМЗ клеток в матрицу рекомбинантного коллагена I типа не была столь успешной, о чем свидетельствует наличие областей одонтокластической активности. Текущие клинические испытания, проведенные Dr. Misako Nakashima и его коллегами из Японии, исследуют безопасность и эффективность трансплантации постнатальных стволовых клеток для лечения некротических постоянных зубов.

Китаева Алена

Комментарии